此前，“袁來如此”專欄就LBA定量方法的監(jiān)管驗(yàn)證展開了第一、二期的詳細(xì)介紹，本期將延續(xù)前兩期的內(nèi)容，繼續(xù)分享后續(xù)相關(guān)內(nèi)容。
1.精密度和準(zhǔn)確度
在方法開發(fā)之前或期間，應(yīng)確定最低可接受的準(zhǔn)確度和精密度，并在該分析方法的生命周期內(nèi)使用，同時(shí)應(yīng)用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)方法計(jì)算運(yùn)行內(nèi)和運(yùn)行間的精密度（precision）和方法準(zhǔn)確度（平均偏差mean bias）。表 VII A 中提供了適用于方法開發(fā)和研究前驗(yàn)證數(shù)據(jù)計(jì)算的示例，表 VII B提供了相關(guān)公式。
表 VII A . 準(zhǔn)確度和精密度的示例。重復(fù)多孔分析的結(jié)果來自一個(gè)蛋白藥物的免疫分析數(shù)據(jù)。在Excel電子表格中，使用方差分析（ANOVA）計(jì)算了相關(guān)統(tǒng)計(jì)結(jié)果。所有數(shù)據(jù)的符號(hào)表示法在表VII B中列出。
表 VII B.表VII A.中數(shù)字示例的符號(hào)表示法
運(yùn)行內(nèi)精密度：從計(jì)算的運(yùn)行平均值，估算測(cè)定濃度值的混合運(yùn)行內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)方差（SW）?？傠S機(jī)誤差，通常稱為運(yùn)行間精密度（或中間精密度intermediate precision），從所有運(yùn)行的累積平均值，估算所有測(cè)定的濃度值的標(biāo)準(zhǔn)方差（）。如出現(xiàn)后一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)方差稍微低估了真正的運(yùn)行間的非精密度（imprecision），使用方差分析（ANOVA），則能夠計(jì)算更準(zhǔn)確的數(shù)值 （SIP）（見表VII A）。
方法的準(zhǔn)確度（表示為%RE）由加權(quán)樣品平均值（weighted sample mean）與樣品標(biāo)稱參考值μT（sample nominal reference value， 50ng/mL in表VII A）的百分比偏差（percent deviation）確定。當(dāng)所有分析運(yùn)行的重復(fù)孔數(shù)相同時(shí)，加權(quán)平均值（weighted mean）和樣品總體平均值（ sample overall mean）相等，將標(biāo)準(zhǔn)方差除以樣品標(biāo)稱值，即得出精密度，以%CV作單位記錄。
在某些應(yīng)用場(chǎng)景中，例如當(dāng)基質(zhì)中存在內(nèi)源性化合物且無法剔除時(shí)，則沒有標(biāo)稱值可用；因此，必須用計(jì)算出的樣本平均值替換%CV計(jì)算中的標(biāo)稱值。在這種情況下，在驗(yàn)證之前，還必須科學(xué)合理地計(jì)算回收率，并將其用于評(píng)估準(zhǔn)確度。
在方法開發(fā)的早期，可以計(jì)算校準(zhǔn)品的%CV和平均RE，預(yù)測(cè)該分析方法可能達(dá)到的精密度和準(zhǔn)確性的最佳值。
要得到預(yù)期分析性能更可靠的評(píng)估，可以獨(dú)立制備額外的加標(biāo)對(duì)照樣本組，并至少進(jìn)行3次分析運(yùn)行。所制備的樣品的濃度應(yīng)包括校準(zhǔn)品的整個(gè)范圍（例如，6至9個(gè)濃度點(diǎn)），對(duì)每次運(yùn)行中的每個(gè)濃度點(diǎn)，至少進(jìn)行復(fù)孔（duplicate）測(cè)定。由內(nèi)插計(jì)算得出的樣品濃度，將反映來自校準(zhǔn)品的變異性、來自樣品制備和位置等其他因素的變異性。表VI中所建議的每個(gè)濃度的累積 %CV和絕對(duì)平均RE（平均偏差mean bias）的目標(biāo)限度為20%（LLOQ為25%），這與研究前驗(yàn)證評(píng)估時(shí)的精密度和準(zhǔn)確性的目標(biāo)限度相同。
在研究前驗(yàn)證期間，可通過分析驗(yàn)證樣品確認(rèn)方法精密度和準(zhǔn)確性。在預(yù)期未知樣本的基質(zhì)中，制備5個(gè)或更多濃度的驗(yàn)證樣品如下：預(yù)期的定量下限（LLOQ）、小于LLOQ的1/3的濃度、中濃度、高濃度和預(yù)期的定量上限（ULOQ），建議再進(jìn)行最少6次分析，對(duì)每次運(yùn)行的每個(gè)樣本至少進(jìn)行2次獨(dú)立分析(復(fù)孔)。對(duì)于每個(gè)驗(yàn)證樣品，應(yīng)使用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)方法一起分析所有運(yùn)行的復(fù)孔測(cè)定值（請(qǐng)參閱表VII）。
如認(rèn)為方法可以接受，建議運(yùn)行間精密度（%CV）和絕對(duì)平均偏差（%RE）均須 ≤20%（LLOQ 為25%）。此外，建議將方法總誤差（%CV和絕對(duì)%RE的總和）定為≤30%（LLOQ為40%），以符合研究中驗(yàn)證的接受標(biāo)準(zhǔn)。
每個(gè)研究中運(yùn)行的精密度和準(zhǔn)確性是通過評(píng)估QC樣品的分析結(jié)果來監(jiān)控的。對(duì)于色譜類和LBA方法都采用同樣的運(yùn)行接受標(biāo)準(zhǔn)：每個(gè)運(yùn)行至少需要2/3的QC達(dá)到對(duì)應(yīng)的標(biāo)稱參考值的特定百分比（例如15%、20%、25%或 30%）；至少50%QC樣品的分析結(jié)果在指定的限度范圍內(nèi)。對(duì)于傳統(tǒng)小分子藥物的定量分析，一般采用4-6-15規(guī)則，相比之下，在2000年3月的AAPS研討會(huì)上，建議對(duì)大分子的LBA制定4-6-30規(guī)則，本文建議采用4-6-30 規(guī)則。
建議采用研究前驗(yàn)證部分中描述的精密度和準(zhǔn)確度的接受標(biāo)準(zhǔn)，因其計(jì)算簡(jiǎn)單，并與上述研究中的4-6-30 規(guī)則相當(dāng)一致。根據(jù)定義，4-6-30 的接受標(biāo)準(zhǔn)僅基于單個(gè)定量結(jié)果與其標(biāo)稱值的偏差，而不是基于計(jì)算的平均值或標(biāo)準(zhǔn)方差，由于分析結(jié)果與標(biāo)稱值的偏差包括隨機(jī)誤差和系統(tǒng)誤差，因此它是一個(gè)總誤差的度量（圖4）。
圖4. 定量分析結(jié)果總誤差（z）的說明。總誤差定義為分析結(jié)果與其標(biāo)稱“真實(shí)”值 (μT)的偏差（deviation）。一般假定均勻樣品的重復(fù)測(cè)定結(jié)果的誤差服從鐘形的正態(tài)分布。為便于比較，誤差通常表示為百分比相對(duì)誤差 (參見圖中刻度)；計(jì)算方法是將偏差除以標(biāo)稱值，再乘以100。總誤差等于系統(tǒng)誤差的總和（systematic component，由計(jì)算出的分析平均值與標(biāo)稱值的偏差來估計(jì)），再加上隨機(jī)誤差（random component，由一個(gè)分析結(jié)果與分析平均值的偏差來估計(jì)）。
附加的研究前驗(yàn)證的限制條件，即%CV和絕對(duì)%RE的總和≤30%，以防止接受具有高度不精密（imprecision）和高度偏差（bias）的分析結(jié)果(例如接近20%)。這樣的分析方法往往不能通過4-6-30標(biāo)準(zhǔn)。其它確保研究前和研究中接受標(biāo)準(zhǔn)之間的一致性的統(tǒng)計(jì)方法亦可接受。
對(duì)于免疫測(cè)試和其它LBA方法，其定量范圍應(yīng)基于最低（LLOQ）和最高（ULOQ），滿足目標(biāo)精密度和準(zhǔn)確度標(biāo)準(zhǔn)的驗(yàn)證樣品，而不是校準(zhǔn)品的性能。
用于定義定量范圍的驗(yàn)證樣品是在未稀釋的樣本基質(zhì)中制備的。在分析之前，它們可能需要進(jìn)行最低限度的稀釋（minimal required dilution，MRD）。在需要使用 MRD 的情況下，可以將定量范圍定義為純粹基質(zhì)中的標(biāo)準(zhǔn)濃度值，或者定義為應(yīng)用 MRD 后獲得的標(biāo)準(zhǔn)濃度值范圍。例如在純粹基質(zhì)中，10至100 ng/mL 的校準(zhǔn)曲線等效于應(yīng)用倍數(shù)為10的MRD（即10%基質(zhì)）之后，1到10 ng/mL的校準(zhǔn)曲線范圍。
在方法開發(fā)早期，可以使用回算的標(biāo)準(zhǔn)品濃度值初步估計(jì)定量范圍。稍后，則使用加標(biāo)樣品來優(yōu)化之前估計(jì)的定量范圍。在此階段，在預(yù)期的LLOQ和ULOQ濃度附近分析更多濃度點(diǎn)是有益的。精度剖面圖有助于評(píng)估定量范圍的預(yù)期極限（圖5）。
應(yīng)根據(jù)外加待測(cè)物的驗(yàn)證樣品（spiked validation sample）分析結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確性來建立該分析方法的定量范圍。標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)包括跨越預(yù)期的LLOQ和ULOQ的濃度。LLOQ 和 ULOQ 由最低和最高的驗(yàn)證樣本決定，其精密度（運(yùn)行間%CV）和準(zhǔn)確度（絕對(duì)%RE）均≤20%（LLOQ為25%），兩者的總和≤30%。
在研究前驗(yàn)證時(shí)，確定的定量范圍是在必要時(shí)，樣本稀釋后必須達(dá)到的范圍。對(duì)高于ULOQ的樣本，必須增加稀釋的倍數(shù)后重新分析。如果樣本已達(dá)到最低稀釋要求，且低于最低定量限，則必須報(bào)告為＜LLOQ。在樣本分析期間，如果對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的必要編輯導(dǎo)致沒有標(biāo)準(zhǔn)品達(dá)到或低于經(jīng)過驗(yàn)證的LLOQ，則必須提升LLOQ。在這種情況下，需要將LLOQ上調(diào)到其余標(biāo)準(zhǔn)品中的最低濃度。
在研究前的驗(yàn)證中，必須證明待測(cè)物在樣本基質(zhì)中的穩(wěn)定性。穩(wěn)定性試驗(yàn)應(yīng)盡可能模擬研究樣本的收集、儲(chǔ)存和處理的條件。通常是將待測(cè)物添加到全血（whole blood）以及經(jīng)過處理全血得到的基質(zhì)，如通過血漿（plasma）和/或血清（serum）進(jìn)行評(píng)估的。對(duì)制備和儲(chǔ)存條件的評(píng)估，通常包括工作臺(tái)穩(wěn)定性（bench-top stability）、短期和長(zhǎng)期穩(wěn)定性以及多個(gè)凍融循環(huán)的穩(wěn)定性。在確定操作條件時(shí)，應(yīng)考慮分析物的理化性質(zhì)，還必須建立待測(cè)物的初級(jí)標(biāo)準(zhǔn)溶液在相關(guān)存儲(chǔ)條件下的穩(wěn)定性。
穩(wěn)定性樣品必須與在與采集到的研究樣本相同的基質(zhì)中制備。如果使用剝離或改變了的基質(zhì)制備研究前校準(zhǔn)樣品和QC樣品，則仍必須在未改變的基質(zhì)中制備穩(wěn)定性樣品。在分析方法開發(fā)過程中，制備穩(wěn)定性樣品對(duì)研究前驗(yàn)證期間的中、長(zhǎng)期穩(wěn)定性數(shù)據(jù)的收集有極大的積極作用。因此，在合適的實(shí)驗(yàn)室中盡早制備穩(wěn)定性樣品并保存相關(guān)文檔記錄，可以為建立待測(cè)物的長(zhǎng)期穩(wěn)定性提供一個(gè)良好的開端。穩(wěn)定性評(píng)估可在方法開發(fā)過程中的樣本處理階段進(jìn)行，包括但不限于對(duì)基質(zhì)穩(wěn)定性的評(píng)估：如室溫、凍融循環(huán)等，以確定在分析方法的整個(gè)生命周期中如何處理樣品。
正式的穩(wěn)定性評(píng)估必須在研究前驗(yàn)證中使用已建立的分析方法進(jìn)行。制備穩(wěn)定性樣品時(shí)，必須將待測(cè)物加入到與研究樣本相同的基質(zhì)中，以產(chǎn)生高/低濃度的穩(wěn)定性樣品，這些濃度可以與高/低QC濃度相同。建議使用與QC樣品相同的重復(fù)孔數(shù)來分析穩(wěn)定性樣品。
評(píng)估工作臺(tái)穩(wěn)定性時(shí)，要求處理樣品的方法與樣本收集（研究）和分析現(xiàn)場(chǎng)的處理方法相同，并且應(yīng)在室溫(至少2小時(shí))和冰箱溫度(2°至8°C)(至少24小時(shí))下進(jìn)行。研究人員可將分析物加入新鮮采集的全血來評(píng)估其全血穩(wěn)定性。
以評(píng)估全血待測(cè)物穩(wěn)定性為例，全血樣品中加入分析物，孵育2小時(shí)，每隔一段時(shí)間進(jìn)行樣本處理以獲得血漿或血清；之后，監(jiān)測(cè)處理后樣品的回收率的趨勢(shì)來評(píng)估其穩(wěn)定性。
對(duì)于凍融穩(wěn)定性評(píng)價(jià)，應(yīng)考慮在常規(guī)分析中預(yù)期的凍融循環(huán)次數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)的方法是3次凍融循環(huán)，每次解凍間隔不少于12小時(shí)。凍結(jié)和解凍的速度和冷凍儲(chǔ)存的溫度應(yīng)該模擬樣品在分析前解凍時(shí)的處理方式。評(píng)估長(zhǎng)期的穩(wěn)定性必須考慮到樣本在研究現(xiàn)場(chǎng)和測(cè)試設(shè)施的儲(chǔ)存。在研究的整個(gè)生命周期中，包括研究樣本的分析完成之后，樣本都必須是穩(wěn)定的。測(cè)試的時(shí)間間隔則取決于研究的需要，對(duì)于非常長(zhǎng)期的研究，測(cè)試頻次以比樣本分析更密集，以確?？梢苑峙畏治鰳颖?，直到整個(gè)研究結(jié)束。
對(duì)于保存在-20°C和-70至-80°C樣品是否需要進(jìn)行穩(wěn)定性進(jìn)行研究，可能取決于樣本在-20°C保存的時(shí)間。如果在-20°C冷凍樣本，在-80°C儲(chǔ)存，那么穩(wěn)定性樣品應(yīng)該以同樣的方式制備，在-20°C保存的時(shí)間可以建模，以預(yù)測(cè)其穩(wěn)定性。
新鮮制備的標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線和QC樣品（無論是在可接受的失效期內(nèi)或新鮮制備的），可以作為穩(wěn)定樣品的比較標(biāo)準(zhǔn)。除了全血穩(wěn)定性外，穩(wěn)定性的接受標(biāo)準(zhǔn)與用于QC樣品準(zhǔn)確度和精密度的接受標(biāo)準(zhǔn)相同。如果穩(wěn)定性樣本的測(cè)定值在精密度的接受標(biāo)準(zhǔn)之內(nèi)，那么樣本就被認(rèn)為是穩(wěn)定的，即便觀察到穩(wěn)定性變化的某種趨勢(shì)，可以采用其他評(píng)估方法，如使用置信區(qū)間。在這種情況下，當(dāng)觀測(cè)到的穩(wěn)定性樣品的濃度或響應(yīng)超出了置信區(qū)間的低端，則該樣本不再有效。
通常在研究中驗(yàn)證期間，會(huì)繼續(xù)進(jìn)行穩(wěn)定性評(píng)估。如果研究樣品的處理和儲(chǔ)存條件發(fā)生變化，則必須進(jìn)行額外的穩(wěn)定性評(píng)估，以反映新的條件對(duì)穩(wěn)定性的可能影響。如果無意中將樣品儲(chǔ)存在不同的溫度下，則應(yīng)該在樣品分析之前進(jìn)行該溫度下的穩(wěn)定性研究，以確認(rèn)穩(wěn)定性，并通過更新方法驗(yàn)證報(bào)告的形式進(jìn)行書面體現(xiàn)。當(dāng)一個(gè)時(shí)間點(diǎn)的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)表明樣本失穩(wěn)時(shí)，只要有一個(gè)預(yù)先建立的、確認(rèn)穩(wěn)定性趨勢(shì)的方案, 則仍然可以在直到樣品失穩(wěn)的時(shí)間點(diǎn)以內(nèi)的時(shí)間段進(jìn)行樣品分析；如果下一個(gè)穩(wěn)定性時(shí)間點(diǎn)的樣本分析，否決了之前的樣本穩(wěn)定性趨勢(shì)， 則可以延長(zhǎng)樣本的穩(wěn)定性區(qū)間。
由于許多免疫測(cè)試方法性質(zhì)或格式中的標(biāo)準(zhǔn)曲線定量范圍(LLOQ到ULOQ)可能很窄，有時(shí)甚至<1個(gè)數(shù)量級(jí)。因此，有必要證明，當(dāng)待測(cè)物的濃度超出定量范圍（高于ULOQ）時(shí)，可以稀釋樣本，使待測(cè)物的濃度進(jìn)入經(jīng)驗(yàn)證的定量范圍。進(jìn)行稀釋實(shí)驗(yàn)的另一個(gè)原因是為了識(shí)別可能存在的“prozone”或“鉤狀效應(yīng)”(參見圖6所示，即由高濃度待測(cè)物引起的信號(hào)抑制)。
稀釋線性（dilutional linearity）不應(yīng)與平行性（parallelism）相混淆。平行性必須使用incurred sample，即已測(cè)樣本再分析的真實(shí)樣本，進(jìn)行評(píng)估，而稀釋線性可以使用外加待測(cè)物的QC樣品進(jìn)行評(píng)估。如果在研究前的驗(yàn)證中顯示出稀釋線性，那么在研究中驗(yàn)證時(shí)就不需要使用系列稀釋的QC樣品了。
圖6.鉤狀（Prozone）效應(yīng)的演示。兩個(gè)結(jié)合點(diǎn)EIA的典型S形濃度-響應(yīng)曲線(●)，包括高濃度鉤狀效應(yīng)。具體來說，高濃度的待測(cè)物產(chǎn)生了低于預(yù)期的響應(yīng)。如果沒有鉤狀效應(yīng)，如開環(huán)(○)所示，較高的待測(cè)物濃度將產(chǎn)生 > ULOQ響應(yīng)；如果沒有鉤狀效應(yīng)，曲線的量化范圍在LLOQ和ULOQ之間。LLOQ和ULOQ之外的錨定點(diǎn)僅用于曲線擬合。
稀釋線性應(yīng)在外加待測(cè)物到樣本基質(zhì)中和隨后稀釋而制備的樣品上進(jìn)行評(píng)估。該基質(zhì)可以是單個(gè)樣本或單個(gè)樣本的混合物。選擇混合樣本和單個(gè)樣本取決于來自基質(zhì)的物質(zhì)，如嗜異性抗體（heterophilic antibody）或結(jié)合蛋白（binding protein）。稀釋倍數(shù)應(yīng)使若干個(gè)稀釋后的濃度落在標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量范圍內(nèi)。
在評(píng)估稀釋線性時(shí)，應(yīng)采用比ULOQ大100至1000倍濃度的加標(biāo)樣品；如果不可行時(shí)，應(yīng)努力使其濃度盡可能地高。制備的稀釋樣品應(yīng)包括ULOQ以上的濃度(用于評(píng)估鉤狀效應(yīng))，以及校準(zhǔn)曲線的高、中、低濃度（用于評(píng)估稀釋線性）。通常情況下，單次稀釋的倍數(shù)不超過1:100。
當(dāng)稀釋線性度不足時(shí)，必須建立合適的分析高濃度樣本的策略。在報(bào)告測(cè)定結(jié)果之前，使用MRD或一個(gè)平臺(tái)值（plateau value）可以滿足這種需求。當(dāng)無法實(shí)現(xiàn)稀釋線性時(shí)，也必須建立數(shù)據(jù)報(bào)告的策略，例如在校準(zhǔn)曲線的定量范圍內(nèi)采用最大的稀釋倍數(shù)。
在方法開發(fā)時(shí)建立的稀釋方案應(yīng)在研究前驗(yàn)證中加以確認(rèn)，需要回算每個(gè)單次稀釋后的濃度，并計(jì)算經(jīng)過所有稀釋次數(shù)的最終濃度的累積精密度。每個(gè)稀釋后樣本的回算濃度應(yīng)在標(biāo)稱值（nominal value）或期望值（expected value）的20%以內(nèi)，累積回算濃度的精密度也應(yīng)當(dāng)≤20%。理論上，所制備1000倍于ULOQ的稀釋線性樣本應(yīng)當(dāng)?shù)玫揭粋€(gè)大于ULOQ的回算值，但如果回算值在定量范圍內(nèi)，則可能存在鉤狀效應(yīng)（圖6）。
研究前的驗(yàn)證過程通常會(huì)覆蓋研究樣本的全部稀釋范圍。當(dāng)研究樣本需要稀釋的濃度超過研究前評(píng)估的濃度時(shí)，應(yīng)重復(fù)稀釋線性度研究，以涵蓋該濃度。另一種方法是可以包括一個(gè)稀釋QC樣品，以確認(rèn)稀釋后可以準(zhǔn)確地測(cè)定其濃度。
平行性是分析方法的一個(gè)性能特征，通常在研究中驗(yàn)證期間進(jìn)行評(píng)估。它在概念上類似于稀釋線性，但使用實(shí)際研究樣本或研究中產(chǎn)生的代表相同基質(zhì)和待測(cè)物（待測(cè)物）組合樣本時(shí)，可對(duì)多次稀釋進(jìn)行評(píng)估。
通常不會(huì)在方法開發(fā)的過程中評(píng)估平行性，而是將稀釋線性度用作平行性第一階段的評(píng)估。
在臨床前研究中驗(yàn)證分析方法時(shí)，有時(shí)可以從暴露于高劑量待測(cè)物的動(dòng)物試點(diǎn)研究中獲得樣本。這種類型的樣本可以在研究前驗(yàn)證中評(píng)估平行性。此外，當(dāng)驗(yàn)證一個(gè)分析方法替代另一個(gè)方法時(shí)，并且能獲得含有相同藥物（藥物活性成分）的研究樣本時(shí)，也可以在研究前驗(yàn)證期間評(píng)估平行性。
可以使用一個(gè)研究中的血藥峰濃度（Cmax）樣本來評(píng)估平行性，常用的方法之一是將幾個(gè)Cmax樣本混合，以生成一個(gè)平行性驗(yàn)證樣品。評(píng)估混合樣本的平行性可以避免使用單個(gè)研究樣本而產(chǎn)生的多個(gè)數(shù)值?？梢越邮艿牟黄叫行匀Q于分析方法的預(yù)期應(yīng)用。作為一個(gè)目標(biāo)，建議稀釋的系列樣品之間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（%CV）≤30%，同時(shí)對(duì)樣品稀釋結(jié)果非線性（即非平行性）情況預(yù)先設(shè)定報(bào)告結(jié)果的程序。
穩(wěn)健性/耐用性的關(guān)鍵是解決在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室條件下和在實(shí)際生活變化的情況下該分析方法是否有效的問題。雖然對(duì)于如何確定穩(wěn)健性和耐用性之間的絕對(duì)差異可能存在相當(dāng)大的爭(zhēng)議，但這兩個(gè)參數(shù)都是在不同條件下該分析方法重現(xiàn)性的指標(biāo)。而它們被分開描述，只是為了更清晰地定義，如何在分析開發(fā)和驗(yàn)證生命周期的不同階段對(duì)其進(jìn)行評(píng)估。
方法的穩(wěn)健性取決于在實(shí)施了可能影響分析方法的變化時(shí)，其效能（performance）的一致性（consistency）。因此，必須重視、測(cè)試和記錄這些變化。對(duì)一個(gè)分析方法有影響的變化必須在方法程序或方法SOP中明確記載，可能影響免疫分析方法的一致性的因素包括：孵育溫度、光暴露(ELISA)和基質(zhì)的選擇(血漿、血清、腦脊液)。
一個(gè)分析方法的耐用性（ruggedness）是在實(shí)施日常變化而導(dǎo)致不同操作條件的情況下該方法的一致性。分析人員的變化、不同儀器的使用、運(yùn)行的大小（batch/run size）、日期、時(shí)間或其他環(huán)境因素的變化對(duì)分析方法一致性或耐用性的影響較小。
在方法開發(fā)期間, 評(píng)估的運(yùn)行變量包括但不限于：孵育時(shí)間（分析方法的所有步驟）、孵育溫度（所有步驟）、不同的分析人員和用來進(jìn)行分析的儀器（移液器、移液工作站、清洗儀、讀板機(jī)等）。在研究前驗(yàn)證中，有可能重新評(píng)估這些變量的一部分，但重要的是確保在分析方法最終確定之前對(duì)它們進(jìn)行評(píng)估，以便設(shè)置這些參數(shù)的限制范圍，并進(jìn)行方法驗(yàn)證。
在研究前評(píng)估方法的穩(wěn)健性和耐用性時(shí)，應(yīng)嘗試評(píng)估在研究階段可能影響分析方法的執(zhí)行和效能的各種條件。
在研究結(jié)束時(shí)，對(duì)QC持續(xù)監(jiān)測(cè)的結(jié)果以及對(duì)運(yùn)行內(nèi)/運(yùn)行間的精密度的評(píng)估，可以提供在不同條件下該分析方法的穩(wěn)健性和耐用性的信息。例如，應(yīng)允許孵育時(shí)間有15%的變化（2h ± 15 min），以適應(yīng)在常規(guī)樣本分析時(shí)此類情況發(fā)生的狀況。
方法驗(yàn)證一般可以分為三大類:全面驗(yàn)證、部分驗(yàn)證和交叉驗(yàn)證。對(duì)本文所述的任何新方法都要進(jìn)行全面驗(yàn)證，這個(gè)過程涉及方法開發(fā)、研究前驗(yàn)證和研究中驗(yàn)證。在動(dòng)物物種（例如從大鼠到小鼠）和物種內(nèi)的基質(zhì)發(fā)生變化（例如從大鼠血清到大鼠尿液）時(shí)，需要對(duì)分析方法進(jìn)行全面驗(yàn)證。
當(dāng)方法變更較小時(shí)，可以進(jìn)行部分驗(yàn)證；這其中包括方法轉(zhuǎn)移、抗凝劑的改變（如EDTA、肝素鈉、檸檬酸）、方法的變化（特別是關(guān)鍵試劑如主要抗體或次要抗體）、樣品處理過程的變化（如，血液離心轉(zhuǎn)速，收集容器，儲(chǔ)存條件）、樣品體積、濃度范圍的增加、選擇性問題（同時(shí)用藥）、分析人員資格的認(rèn)證等。部分驗(yàn)證的范圍可以很寬，從運(yùn)行內(nèi)準(zhǔn)確度和精密度的單一評(píng)估，到近乎全面驗(yàn)證。更改試劑批次或樣品處理方法可能只需要一次運(yùn)行。相比之下，分析方法轉(zhuǎn)移可能需要大量的實(shí)驗(yàn)。
方法轉(zhuǎn)移是在一個(gè)實(shí)驗(yàn)室（方法發(fā)出實(shí)驗(yàn)室sending laboratory）建立一個(gè)分析方法并轉(zhuǎn)移到另一個(gè)實(shí)驗(yàn)室（方法接收實(shí)驗(yàn)室receiving laboratory），并且至少需要部分驗(yàn)證的情況。
除了所需的記錄文件（例如方法描述、驗(yàn)證報(bào)告、分析證書/certificate of analysis）外，方法發(fā)出實(shí)驗(yàn)室還應(yīng)提供影響耐用性因素的相關(guān)信息（例如，關(guān)鍵試劑和物料）。需要制定計(jì)劃或方案來確定方法轉(zhuǎn)移流程（例如，要進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)）和接受標(biāo)準(zhǔn)。
一旦方法轉(zhuǎn)移通過驗(yàn)證，一個(gè)理想的做法是讓方法發(fā)出實(shí)驗(yàn)室和接收實(shí)驗(yàn)室分析30個(gè)覆蓋標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍的加標(biāo)盲樣以及30個(gè)混合的、用于已測(cè)樣品再分析的樣品，并使用統(tǒng)計(jì)等效測(cè)試對(duì)兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較?；蛞嗫梢允褂蒙潭ǖ目山邮芊秶容^兩組數(shù)據(jù)之間的差異。
當(dāng)在同一研究或申報(bào)材料中的數(shù)據(jù)是通過兩種驗(yàn)證過的生物分析方法得到時(shí)，需要進(jìn)行交叉驗(yàn)證。例如兩種驗(yàn)證過的生物分析方法是ELISA和BiaCore，或者是ELISA和液相色譜/質(zhì)譜，建議使用測(cè)試樣品（test sample，加標(biāo)樣品和/或混合的已測(cè)樣本再分析樣品）進(jìn)行交叉驗(yàn)證。
在方法開發(fā)過程中，不應(yīng)設(shè)定明確的運(yùn)行接受標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線性能的早期評(píng)估可用于判斷所選試劑和分析格式的適用性。
研究前驗(yàn)證中，應(yīng)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的接受標(biāo)準(zhǔn)而決定是否接受一個(gè)驗(yàn)證運(yùn)行。對(duì)研究前驗(yàn)證樣本則不設(shè)接受標(biāo)準(zhǔn)。例如，在準(zhǔn)確度和精密度評(píng)估期間，不能因?yàn)轵?yàn)證樣本的性能不佳而拒絕一個(gè)分析運(yùn)行；需要報(bào)告所有來自研究前驗(yàn)證運(yùn)行的數(shù)據(jù)。在某些情況下，在計(jì)算累積平均值之前，可能會(huì)有因?yàn)榭梢源_定的原因（例如，技術(shù)問題）而剔除某些驗(yàn)證樣本的數(shù)據(jù)點(diǎn)；但這應(yīng)該在整個(gè)驗(yàn)證研究結(jié)束時(shí)進(jìn)行，并且必須按照文檔記錄的要求記錄。
對(duì)于每個(gè)研究中驗(yàn)證運(yùn)行，標(biāo)準(zhǔn)曲線必須滿足相關(guān)接受標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)于大分子LBA方法，所建議的運(yùn)行接受標(biāo)準(zhǔn)（見有關(guān)準(zhǔn)確度和精密度的章節(jié)）要求：至少6個(gè)QC結(jié)果中有4個(gè)（67%）必須在其標(biāo)稱值的30%以內(nèi)，每個(gè)QC濃度級(jí)別至少有50%的數(shù)值滿足30%的限度。本文所推薦的4-6-30規(guī)則同時(shí)對(duì)所允許的隨機(jī)錯(cuò)誤（不精確度imprecision）和系統(tǒng)誤差（平均偏差mean bias）實(shí)施了限制。如果一個(gè)分析方法要求QC最終接受標(biāo)準(zhǔn)不同于30%的標(biāo)稱值偏差，則應(yīng)調(diào)整對(duì)于精密度和準(zhǔn)確度的研究前驗(yàn)證的接受標(biāo)準(zhǔn)，使運(yùn)行間不精確度和絕對(duì)平均值RE之和的限度值等于修改后的QC的接受限度值。
LBA分析方法的主要用途是支持生物藥在各個(gè)研發(fā)階段的藥代動(dòng)力學(xué)研究。如果早期充分地定義LBA定量分析方法的每個(gè)組成部分，就應(yīng)當(dāng)能夠生成簡(jiǎn)潔的驗(yàn)證計(jì)劃和簡(jiǎn)單明了的驗(yàn)證過程。
如本文所述，一個(gè)典型的方法驗(yàn)證包括至少6次精密度和準(zhǔn)確度的分析，以證明方法效能的一致性（consistency）。在這些分析運(yùn)行中，可以確定其它一些參數(shù)，包括早期的穩(wěn)定性、特異性、選擇性和定量范圍。標(biāo)準(zhǔn)曲線需要至少含有6個(gè)非零點(diǎn)的濃度，并需要評(píng)估其準(zhǔn)確度和精密度。除了真實(shí)的記錄在案的分析人員的錯(cuò)誤外，不應(yīng)該剔除任何分析運(yùn)行及其數(shù)據(jù)。驗(yàn)證樣本定義了該方法的定量范圍，低于LLOQ或高于ULOQ的數(shù)值無需報(bào)告。在6次驗(yàn)證試驗(yàn)中，驗(yàn)證樣本用來確定多次運(yùn)行的累積精密度和準(zhǔn)確度。在驗(yàn)證期間，不應(yīng)該剔除任何驗(yàn)證樣本，以展示該方法的真實(shí)效能。
在樣本分析過程中，方法驗(yàn)證的生命周期仍在繼續(xù)。在接受QC樣品的分析結(jié)果之前，首先根據(jù)預(yù)設(shè)的接受標(biāo)準(zhǔn)，確定標(biāo)準(zhǔn)曲線是否通過。只有當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)曲線通過后，才可以評(píng)估QC樣品是否可接受；之后，再根據(jù)QC的定量結(jié)果確定該分析運(yùn)行是否有效。QC的接受標(biāo)準(zhǔn)可基于4-6-×規(guī)則或總誤差，并且可以基于方法開發(fā)和研究前驗(yàn)證階段所使用的標(biāo)準(zhǔn)來預(yù)測(cè)?？偠灾琇BA定量分析方法是一種高靈敏度的定量方法（常規(guī)可取得pg/mL級(jí)的靈敏度），可用于生物基質(zhì)中的蛋白質(zhì)和多肽生物藥的定量分析。
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